Πέμπτη, 16 Αυγούστου 2012

Polymerase Chain Reaction-Αλυσιδωτη Αντιδραση Πολυμερασης

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, είναι μια μέθοδος η οποία εφευρέθηκε το 1983 από τον Kary Mullis.
Η μέθοδος καταχωρήθηκε στο USPTO (United States Patent & Trademark Office), το φεβρουάριο του 1986 και εγκρίθηκε στις 28 Ιουλίου του επόμενου έτους (www.uspto.gov). Το 1993 πήρε το Nobel χημείας για την ανακάλυψη της PCR (Reece, 2004). H μέθοδος παρέχει τη δυνατότητα παραγωγής in vitro απεριόριστων αντιγράφων μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA και έχει ευρεία εφαρμογή.

Σύμφωνα με τη νέα πρωτοποριακή αυτή μέθοδο, έχουμε τη δυνατότητα να ενισχύουμε καθορισμένα τμήματα DNA, με τη βοήθεια δύο εκκινητών και μιας DNA-πολυμεράσης. Η αντίδραση χωρίζεται σε τρία στάδια. Το πρώτο αφορά την αποδιάταξη, του δίκλωνου μορίου DNA, στις δύο συμπληρωματικές του με θέρμανση στους 94 oC. Στη συνέχεια η θερμοκρασία ελαττώνεται, και κάθε ένας από τους εκκινητές προσδένεται στο συμπληρωματικό του κομμάτι στην αρχική αλυσίδα-μήτρα . Το επόμενο βήμα είναι η σύνθεση της νέας αλυσίδας με τη βοήθεια της DNA πολυμεράσης . Ας αναφερθούμε εκτενέστερα στα τρία στάδια της αντίδρασης, έχοντας ως οδηγό και την εικόνα 
 Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, ένα δίκλωνο μόριο DNA, μπορεί να διαχωριστεί στις δύο συμπληρωματικές αλυσίδες του με θέρμανση. Η κατάλληλη θερμοκρασία για να επιτευχθεί η αποδιάταξη είναι οι 94 οC (denaturation). Στη συνέχεια το μίγμα ψύχεται, δίνοντας την δυνατότητα στους δύο ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές να προσδεθούν στις αποδιαταγμένες αλυσίδες (annealing). Οι δύο εκκινητές (primers), πρέπει να είναι σχεδιασμένοι με τέτοιο τρόπο, ώστε το 3΄  ελεύθερο άκρο του καθένα, να είναι απέναντι από το άκρο του άλλου, ούτως ώστε η σύνθεση του DNA να περιλαμβάνει μόνο το κομμάτι που βρίσκεται μεταξύ τους. Η θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών, εξαρτάται από το μήκος τους, την αλληλουχία τους, καθώς και από την ειδικότητα της εκάστοτε αντίδρασης PCR. Το τελευταίο βήμα αφορά τη σύνθεση του νέου τμήματος (elongation-extension). Μια DNA πολυμεράση προσδένεται στο ελεύθερο 3΄ άκρο του κάθε προσδεδεμένου εκκινητή, και χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδια (dNTPs), συνθέτει μια νέα αλυσίδα DNA με κατεύθυνση 5΄→3΄. Το μέγεθος του τμήματος DNA που συντέθηκε καθορίζεται από την απόσταση ανάμεσα στο τμήμα που έχουν υβριδιστεί οι εκκινητές. Είναι εύλογο το ερώτημα με ποιο τρόπο τερματίζεται η σύνθεση του νεοσυντιθέμενου μορίου DNA. Δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμενο σημείο τερματισμού, και η σύνθεση σταματάει μόνο κατά την αύξηση της θερμοκρασίας στον επόμενο κύκλο και την αποδιάταξη των νέων δίκλωνων μορίων. Τα νέα μόρια έχουν καθορισμένα 5΄ άκρα, εφόσον αυτά υπαγορεύονται από τους εκκινητές, αλλά ακανόνιστα 3΄ άκρα. Στον επόμενο κύκλο τα δύο υπάρχοντα δίκλωνα μόρια θα αποδιαταχθούν και τώρα θα υπάρχουν τέσσερα μόρια-μήτρες για την πρόσδεση των εκκινητών. Έτσι, τα παραγόμενα μόρια, αυξάνονται με εκθετικό ρυθμό. Να σημειωθεί, ότι η αύξηση δεν είναι εκθετική μετά από αρκετούς κύκλους, καθώς τα αντιδραστήρια του μίγματος ελαττώνονται. Θεωρητικά πάντα βέβαια, παραδεχόμαστε ότι η αύξηση γίνεται με εκθετικό τρόπο. Αντίθετα, τα παραγόμενα μόρια που δεν έχουν το ζητούμενο μέγεθος, αυξάνονται με γραμμικό τρόπο, και έτσι δεν επηρεάζουν  το τελικό προϊόν της αντίδραση.

  Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης έχει ανατρέψει τη μοριακή βιολογία επιτρέποντας την ενίσχυση και τον χαρακτηρισμό πολύ μικρών ποσοτήτων νουκλεϊκών οξέων. Η χρησιμότητα της είναι ιδιαίτερα σημαντική στις βιολογικές επιστήμες, όπου και επιτρέπει την ταυτοποίηση μεταλλάξεων σε πολύ μικρές ποσότητες του ανθρωπίνου DNA, αλλά και στην παθολογία, όπου χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό μολυσματικών μικροοργανισμών.  Παρακάτω αναφέρονται οι βασικές εφαρμογές τις PCR:

*      Μοριακή κλωνοποίηση
*      Αλληλουχοποίηση DNA
*      Αρχαιολογία
*      Ενίσχυση άγνωστων αλληλουχιών
*      Κλινική παθολογία
*      Γενετική διαγνωστική
*      Χαρακτηρισμός άγνωστων μεταλλάξεων
*      Ανάλυση πληθυσμών
*      Γενωμική ανάλυση
*      Ποσοτική PCR του RNA ή DNA.
*      Πληθυσμιακές μελέτες

Πηγές:
  • Αποστόλου Κ. Παναγιώτης (2006). Η εφαρμογή της πολλαπλής αλυσιδωτής αντίδρασης για την ανίχνευση μονών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών μίας βάσης (SNPs) ως μέσο διάκρισης των φυλογενετικών ομάδων της πέστροφας (Salmo trutta). Διπλωματική εργασία.

0 σχόλια:

Δημοσίευση σχολίου